La Leucemia Linfoblastica Acuta (LLA) è la più frequente forma tumorale dell’età pediatrica, per la quale nonostante i progressi nella cura ottenuti negli ultimi decenni, una parte importante dei pazienti, circa il 25%, ad oggi non risponde adeguatamente alle cure. Il differente esito clinico che si osserva nei bambini con LLA può essere attribuito alla loro diversa sensibilità verso i farmaci, e ciò deriva dalle specifiche alterazioni genetiche che contraddistinguono altrettanti sottogruppi di questa malattia. La comprensione dei meccanismi responsabili dell’insorgenza della malattia e della diversa risposta alle terapie rappresentano oggi le sfide più importanti della ricerca nel campo della LLA pediatrica.

Nella nostra unità di ricerca ci siamo dedicati in particolare allo studio dei segnali cellulari che possono determinare il comportamento della cellula leucemica, in particolare ci siamo posti tre obiettivi:

• Comprendere meglio i meccanismi che determinano il comportamento cellulare in risposta alla terapia con particolare riferimento a quelli responsabili della resistenza o della ricaduta.
• Individuare nuovi target terapeutici.
• Predire la ricaduta della malattia.

Nei nostri studi abbiamo studiato le cellule leucemiche di campioni di LLA pediatrica focalizzando la nostra attenzione sui pazienti ad alto rischio di ricaduta di malattia post-terapia. Tra questi abbiamo identificato uno specifico sottogruppo caratterizzato da una alterazione del gene CRLF2. Nei campioni di questi pazienti abbiamo testato in vitro farmaci di nuova generazione che potrebbero risultare più efficaci nel trattamento di questi pazienti. Per fare ciò ci siamo avvalsi di una tecnologia innovativa, nota come citrometria di massa (CyTOF), che consente di analizzare simultaneamente un numero elevato di parametri in ogni singola cellula. Gli studi sono stati realizzati in collaborazione con il laboratorio del Prof. Garry Nolan dell’Università di Stanford (USA). Questi studi sono stati portati avanti principalmente dalla dottoressa Jolanda Sarno (dottorato di ricerca conseguito presso il nostro centro di ricerca) che ha lavorato presso il laboratorio di Stanford sotto la supervisione della dottoressa Kara Davis. 

Questi studi ci hanno permesso di giungere ad alcuni importanti risultati:

• I pazienti con LLA recanti una alterazione del gene CRLF2, presentano l’attivazione di alcune proteine coinvolte nei meccanismi responsabili dell’insorgenza della leucemia, inoltre abbiamo dimostrato che l’utilizzo in combinazione di alcuni farmaci inibitori, già utilizzati per altri sottotipi leucemici, sia in grado di spegnere efficacemente i segnali attivati nella cellula leucemica causandone la sua distruzione (Sarno J, et al Oncotarget. 2018). 
• Nel secondo studio le cellule leucemiche sono state confrontate con la loro controparte sana mediante un programma innovativo di biostatistica al fine di individuare i profili (signatures) piu’ caratteristici delle cellule leucemiche. Il modello statistico utilizzato, definito come Developmentally Dependent Predictor of Relapse (DDPR) ha dimostrato chiaramente che alcune caratteristiche funzionali della cellula tumorale responsabili della ricaduta sono presenti già alla diagnosi e persistono nella ricaduta. In particolare il nostro modello ha individuato 6 caratteristiche cellulari presenti in 2 sottopopolazioni leucemiche in grado di far prevedere la ricaduta del paziente fin dal momento della diagnosi. L’analisi delle coppie di campioni diagnosi-ricaduta ha confermato in una successiva analisi la persistenza di questi 6 profili predittivi nelle cellule della ricaduta. In conclusione una analisi ad altissima risoluzione a livello di singola cellula è in grado di identificare un preciso comportamento cellulare come driver della ricaduta. Tale osservazione, oltre ad offrire nuove conoscenze sul comportamento biologico della cellula tumorale, potrebbe avere un impatto molto significativo negli attuali criteri di stratificazione del rischio e conseguente assegnazione del braccio terapeutico (Good Z, Sarno J, et al Nat Med. 2018).

Piu’ recentemente abbiamo voluto concentrare i nostri sforzi su un altro sottogruppo di LLA infantili: La leucemia linfoblastica acuta a cellule T (LLA-T). Si tratta di una malattia che deriva dall’espansione clonale dei precursori delle cellule T trasformate. Nonostante il buon successo che si osserva nella maggior parte dei pazienti, quelli con malattia resistente o recidivante hanno una prognosi decisamente sfavorevole. Le lesioni genomiche all’origine di T-ALL che contribuiscono all’espansione della leucemia e all’aggressività della malattia sono ampiamente studiate e la maggior parte dei geni mutati responsabili della LLA-T sono noti per essere coinvolti in importanti vie di trasduzione del segnale intracellulare portando alla loro attivazione aberrante. Per questo motivo sono necessari ulteriori sforzi per comprendere meglio l’impatto clinico e biologico di queste alterazioni.

A questo scopo abbiamo intrapreso diversi progetti:
1) Stiamo caratterizzando in modo fine i segnali specifici associati al alla malattia a livello di singola cellula utilizzando tecnologie ad alto rendimento quali la citometria di massa e il sequenziamento di prossima generazione (NGS). Tale approccio innovativo allo studio del profilo genomico e funzionale di T-ALL è fondamentale per rapidi progressi nell’identificazione di nuovi bersagli terapeutici che possono contribuire al miglioramento della prognosi di questi pazienti. Questo progetto è condotto principalmente dalla dottoressa Cristina Bugarin in collaborazione con l’unità del Dottor Giovanni Cazzaniga (dottoressa Grazia Fazio) e con il Dottor Tomas Kalina (CLIP Cytometry, Paediatric Haematology and Oncology Department, 2nd Faculty of Medicine, CU, and Teaching Hospital Motol, Prague, Repubblica Ceca).
2) Abbiamo studiato e caratterizzato un nuovo anticorpo monoclonale umanizzato specifico verso una molecola espressa in maniera specifica nelle cellule di LLA-T (si tratta di un epitopo glicosilato dell’antigene CD43). La dottoressa Chiara Buracchi ha dimostrato che questo anticorpo si è rivelato efficace sia in vitro che in vivo nella distruzione delle cellule di LLA-T mediante un meccanismo (ADCC) che utilizza il sistema immunitario del paziente. Il progetto è condotto in collaborazione con Dott. Ciro Botta ed il Prof. Pierfrancesco Tassone dell’Università Magna Graecia di Catanzaro, ed il manoscritto è in preparazione per essere sottoposto ad una rivista scientifica internazionale.
3) Nell’ambito delle LLA-T stiamo indagando un sottogruppo di pazienti caratterizzati dalla mutazione del gene PTEN. In questo studio abbiamo mappato con la citometria a flusso i segnali piu’ importanti che caratterizzano queste cellule ed abbiamo osservato alcuni comportamenti peculiari che potrebbero avere un impatto nella risposta delle cellule al microambiente midollare e alla risposta ad alcuni farmaci. Questo progetto è portato avanti prevalentemente dalla dottoressa Cristina Bugarin ed è in collaborazione con il dottor Luca Lonigro e dottoressa Paola Bonaccorso, Centro di Oncoematologia Pediatrica, Azienda Policlinico – Catania. Il manoscritto è in preparazione per essere sottoposto ad una rivista scientifica internazionale.

Infine stiamo conducendo uno studio su una malattia oncoematologica molto rara, la leucemia mielomonocitica giovanile (JMML). Si tratta di una malattia mieloproliferativa della prima infanzia caratterizzata da una eccessiva proliferazione di cellule mielomonocitiche. I criteri diagnostici per definire la JMML sono attualmente ben stabiliti, tuttavia, in alcuni pazienti la diagnosi di JMML rimane ancora una molto difficile e complessa con un impatto sul percorso di cura e sulla ricerca del donatore per il trapianto di midollo osseo. Nell’ambito del consorzio Euroflow (di cui il nostro laboratorio fa parte) abbiamo caratterizzato mediante citometria a flusso il compartimento delle cellule progenitrici (CD34-positive) della JMML usando un pannello di anticorpi monoclonali in grado di definire con precisione tutto il profilo maturativo di queste cellule.

Grazie a questo studio (condotto in collaborazione con 7 centri europei) abbiamo potuto stabilire per la prima volta che le cellule progenitrici CD34 + dei pazienti JMML presentano un profilo immunofenotipico unico che le distingue in modo sensibile ed accurato dalla controparte normale Questa nuova caratterizzazione immunofenotipica è realizzabile sia nel midollo osseo che nel sangue periferico la sua applicazione di routine potrebbe contribuire a una diagnosi rapida e più precisa di JMML. Lo studio è stato condotto principalmente dalla dottoressa Cristina Bugarin in collaborazione con il consorzio Europeo Euroflow. Il manoscritto è in via di preparazione per essere sottomesso ad una rivista scientifica internazionale.